ในอณูชีววิทยาการเลือกบัฟเฟอร์ที่ดีและการเตรียมการสำหรับขั้นตอนการแยก DNA ที่แตกต่างกันอาจเป็นความแตกต่างระหว่างการย้ายไปสู่การแสดงออกของโปรตีนหรือการเปิดชุด maxi-Prep อีกชุดหนึ่งเพื่อเริ่มต้นใหม่ ทั้งๆที่มีความสำคัญอย่างยิ่งสูตรบัฟเฟอร์ก็มักจะเป็นเช่นนั้น - สูตรที่เขียนโดยไม่มีคำอธิบายหรือเหตุผลสำหรับส่วนประกอบต่าง ๆ หนึ่งในนั้นคือบัฟเฟอร์กลูโคส - ทริส - EDTA หรือ GTE บัฟเฟอร์
$config[code] not foundGTE ใช้สำหรับทำอะไร
GTE ใช้เพื่อแขวนตะกอนเซลล์แบคทีเรียอีกครั้งก่อนที่จะทำการไล (เปิด) เซลล์และเก็บเกี่ยว DNA พลาสมิดภายใน ไลโซไซม์ซึ่งทำให้เยื่อหุ้มเซลล์อ่อนตัวมักถูกเติมพร้อมกับบัฟเฟอร์ GTE การระงับการเป็นเนื้อเดียวกันของเซลล์ทั้งหมดในระหว่างขั้นตอนนี้เพื่อให้สารละลาย lysis ที่เพิ่มเข้ามาสามารถเข้าสู่เซลล์ทั้งหมดเป็นกุญแจสำคัญในการได้รับ DNA ที่ดี GTE ถูกออกแบบมาเพื่อทำสิ่งนี้ในขณะเดียวกันก็ให้สภาพแวดล้อมที่มั่นคงสำหรับ DNA
กลูโคสสำหรับออสโมลาริตี
น้ำตาลกลูโคส 50mM (millimolar) ถูกเพิ่มเข้าไปในบัฟเฟอร์ GTE เพื่อรักษา osmolarity โดยที่ความเข้มข้นของตัวถูกละลายภายนอกเซลล์นั้นใกล้เคียงกับที่อยู่ภายในเซลล์ สิ่งนี้จะช่วยป้องกันการสลายเซลล์ก่อนวัยอันควรซึ่งอาจทำให้ดีเอ็นเอลดลงเนื่องจากการรวมตัวและการย่อยสลาย ส่วนประกอบอื่น ๆ ของบัฟเฟอร์ยังมีส่วนช่วยในการออสโมลาริตีของการแก้ปัญหา แต่กลูโคสที่ไม่ใช่อิเล็กโทรไลต์เป็นทางเลือกที่ดีเพราะมันไม่รบกวนคุณสมบัติบัฟเฟอร์ของสารละลาย
Tris สำหรับความเสถียรของค่า pH
Tris เป็นชื่อย่อของ tris (hydroxymethyl) aminomethane ซึ่งเป็นบัฟเฟอร์ pH ที่พบได้บ่อยมาก ในกรณีของบัฟเฟอร์ GTE นั้นเกลือของกรด (Tris-HCl) จะถูกเพิ่มเข้าไปในบัฟเฟอร์ที่ความเข้มข้น 25mM สิ่งนี้จะรักษาค่า pH ของสารละลายที่ค่าใกล้เคียงทางสรีรวิทยา 8.0 ซึ่งเป็นค่า pH ที่เหมาะสมสำหรับการป้องกันการย่อยสลายกรดของการย่อยสลายของดีเอ็นเอพลาสมิดและปฏิกิริยาข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์ของส่วนประกอบเซลล์อื่น ๆ
EDTA ป้องกันการเสื่อมสภาพของดีเอ็นเอ
EDTA หรือเอทิลเรียมแอมมีเนตเอทเทติกกรดจับหรือ "คีเลต" ไอออนโลหะออกจากสารละลายป้องกันไม่ให้พวกเขามีส่วนร่วมในปฏิกิริยาข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์ ในบัฟเฟอร์ GTE จะเพิ่ม EDTA ที่ 10mM จุดประสงค์หลักของมันคือในบัฟเฟอร์เพื่อปัดเศษสังกะสีอิสระแมกนีเซียมและแคลเซียมออกให้หมดดังนั้นจึงป้องกันการเสื่อมสภาพของดีเอ็นเอโดยวิถีบางอย่างที่ต้องการโลหะเหล่านั้น
เคล็ดลับที่สำคัญ
รักษาบัฟเฟอร์ GTE ของคุณให้เย็นและทำให้มันอยู่ในปริมาณเล็กน้อยเพื่อป้องกันการเติบโตของแบคทีเรียที่ไม่ได้ตั้งใจ น้ำตาลและค่า pH ที่ควบคุมทำให้เป็นสื่อการเติบโตที่ยอดเยี่ยม ใช้น้ำบริสุทธิ์เสมอ น้ำประปาสามารถมีไอออนโลหะเกินจากท่อซึ่งสามารถครอบงำความสามารถของ EDTA ในการจับ หากคุณสงสัยว่ามีการรบกวน RNA ในตัวอย่างของคุณให้เพิ่ม RNase A ที่ 100 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตรในบัฟเฟอร์ GTE ของคุณเพื่อกำจัดปัญหา
